Александр Александрович Максимов - Василий Николаевич Манских

«Материалом для настоящего исследования служили взрослые, но по возможности молодые кролики. Эти животные благоприятны (напр., в сравнении с морскими свинками) особенно потому, что плазма их свертывается очень медленно.

О технике приготовления самих культур я не буду распространяться особенно подробно. Она, в основе, конечно, соответствовала столь часто и столь многими описывавшейся Каррелевской технике (см. Carrel[92], Drew[93] и др.). Но понятно само собою, что при такого рода работе каждый исследователь, применяясь к окружающей обстановке, всегда сам поневоле создает множество более или менее существенных видоизменений того или другого приема, которые весьма важны для успеха дела, но описание которых представляется совершенно невозможным.

Каждый опыт всегда начинается с получения питательной среды, каковою служила плазма крови, взятая от того же самого животного (аутогенная) или от другого кролика (гомогенная). Кровь добывалась всегда из сонной артерии, причем я пользовался предложенным Е. Лондоном кровеприемником (Шеремецинская и Миронова[94]). Само собой понятно, что канюля, соединительная трубка и сам приемник предварительно тщательно промасливались и парафинировались, что приемник помещался в сосуд со льдом, что все инструменты и приборы стерилизовались и т. д. Кровеприемник с кровью тотчас переносился в наполненный льдом стаканчик довольно большой электрической центрифуги и кровь центрифугировалась при 3500 оборотах 3–4 минуты. Прозрачная плазма отсасывалась особой вздутой парафинированной пипеткой, помещалась в новый маленький парафинированнй приемник с притертой крышкой и сохранялась до употребления при температуре тающего льда.

Так как Carrel, а за ним и многие авторы указывают на то, что рост in vitro более пышен, если плазма слегка гипотонична, и так как при последующих, довольно кропотливых манипуляциях неизбежно происходит сгущение плазмы вследствие испарения, то к плазме до ее применения обыкновенно прибавлялась стерильная дистиллированная вода в количестве приблизительно одной трети объема воды на две трети объема плазмы.

Из тканей, предназначенных для посева, в совершенно свежем, живом их состоянии стерильно вырезывались небольшие кусочки, помещались в теплую Рингеровскую жидкость и здесь окончательно размельчались тонкими ножницами на мельчайшие частицы, диаметром для лимфатических узлов, костного мозга и т. под. органов в 1/4–1/3 миллим., для рыхлой же подкожной соединительной ткани (подкожной и межмышечной клетчатки из брюшной стенки кролика) несколько большего размера.

В качестве влажной камеры служили большие и толстые объектные стекла с глубокой выемкой диаметром в 35 миллим.; они помещались поодиночке в чашки Petri, стерилизовались и края углубления обводились стерильным вазелином.

На поверхность большого покровного стекла (40 × 40 миллим.), помещенного рядом с объектным в той же чашке Petri, наносилась капля плазмы достаточной величины, а затем в эту каплю тотчас же переносился из Рингеровской жидкости на тонком шпателе или просто на иголке предназначенный для культуры кусочек. Если это был кусочек рыхлой соединительной ткани, то он всегда еще слегка расправлялся стеклянными иголками в капле плазмы, чтобы слой ткани был по возможности тонок и доступен для прижизненного наблюдения.

Когда капля плазмы через несколько минут свернулась, покровное стекло перевертывается, накладывается на обведенный вазелином край углубления на объектном стекле, обмазывается еще расплавленным парафином и чашка Petri с такой влажной камерой ставиться в термостат при 38°. Получаются, следовательно, культуры в т. н. висячей капле.

Само собою понятно, что в течение всех этих манипуляций также нужно соблюдать строжайшую асептику и притом по возможности быстро работать. При некотором навыке и наличности хорошо дисциплинированных помощников (не менее двух) работа эта не представляет особых трудностей; даже в нашем старом Анатомическом Институте, представляющем, вероятно, наиболее неблагоприятную для таких опытов обстановку, какую только можно себе представить, мне при многих сотнях культур почти никогда не приходилось наблюдать бактериального или плесневого загрязнения, и из посеянных культур успешное развитие констатировалось неизменно в почти 100 %.

Если желательно продлить жизнь ткани вне организма, то, по примеру Carrel и других, следует пересевать ее на новую среду, в новую влажную камеру. Так как я в настоящей работе имел дело с тканями взрослых животных, сравнительно медленно растущими, то мне приходилось делать пересевы обыкновенно на 5 или даже на 6 день.

Сперва приготовляется обычным путем кровяная плазма. Покровное стекло культуры снимается, перевертывается и тонкими ланцетовидными иглами из студенистой массы капли плазмы вырезывается либо вся ткань, либо только одна какая-нибудь ее часть, напр. новообразованная, растущая зона и перекладывается в заранее приготовленную теплую Рингеровскую жидкость. Здесь кусочки, если нужно, разрезываются на более мелкие частицы и после такой „ванны“, длящейся 1/4-1/2 часа или меньше, вновь засеиваются обычным путем в новые камеры, в такие же капли плазмы, как прежде.

Повторяя такие пересевы, мне удалось получить из нескольких первоначальных культур рыхлой соединительной ткани взрослого кролика очень большое количество новых культур, перенесших частью до 12 пересадок и достигших возраста 63 дней; существование этих культур прекратилось только потому, что я должен был в то время прервать работу.

В последнее время, как известно, для изучения соединительной ткани и крови часто применялась прижизненная окраска всего организма трипановой или изаминовой синькой (Чашин[95]). Вполне естественно было применить способ и для культуры тканей, и это, действительно, и было сделано Hofmann[96]. Я также неоднократно сеял кусочки тканей в синюю плазму. Она получалась таким образом, что непосредственно перед добыванием крови кролику в вену уха впрыскивалось достаточное количество раствора трипановой синьки. Несмотря на то, что ткани росли в синей плазме так же хорошо, как и в нормальной и что определенные виды элементов (именно блуждающие клетки в покое, см. ниже) очень резко окрашивались, этот способ пока для моих целей особых результатов не дал, так как такие культуры пригодны собственно только для исследований в свежем состоянии; фиксация формалином, обыкновенно применявшаяся для окрашенных при жизни тканей, в применении к культурам дает очень неблагоприятные результаты в смысле сохранения клеточных структур и отчетливости гистологической картины и кроме того культуры не могут быть разрезаны на замораживающем микротоме. Другие же фиксаторы почти всегда более или менее сильно обесцвечивают ткань» {57, с. 125–128}.

Е) Техника выполнения гистологических рисунков. Этот краткий раздел нужно начать с замечания об одной вещи, о которой сегодня помнят уже очень немногие профессиональные морфологи. Для большинства из них точные микроскопические рисунки гистологов прошлого кажутся чем-то магическим, так как процесс рисования они представляют, исходя из собственного опыта, полученного на занятиях по гистологии в университете, т. е. с помощью учебного микроскопа, бумаги и карандашей. Конечно, профессиональный гистологический рисунок так сделать нельзя и ссылки преподавателей на изображения старых