Путешествие Колдуна II. Экспедиция, которая раскрыла секреты микробиома океана - J. Craig Venter

"Нужно было уметь вскрыть все клетки. Поэтому они попробовали несколько различных экспериментальных протоколов, чтобы извлечь всю ДНК.

 

У микробиологов команды был опыт вскрытия клеток, а у Джеффа - опыт работы с микробами пустынной почвы. Некоторые клетки из почвы очень трудно вскрыть, потому что они образуют маленькие микрокапсулы. Каждый член команды предлагал различные протоколы, которые позволяли вскрыть все клетки и получить наибольшее количество ДНК".

Следующие шаги заключались в создании нескольких копий ДНК в образцах, а затем в буквальном смысле разбиении ДНК на фрагменты размером от пятисот до двух тысяч пар оснований с помощью аппарата, называемого распылителем. Затем фрагменты пропускались через один из секвенаторов Applied Biosystems, который отмечал и идентифицировал каждую генетическую букву.

После завершения секвенирования и компьютерной обработки файлов команда вычислительных биологов из института взяла цифровые последовательности и принялась за работу, пытаясь собрать эти фрагменты кода в естественные хромосомы организма. Для этого команда искала совпадения в коде разных фрагментов. Подробное описание того, как это делается, представлено Национальным центром биотехнологической информации в его справочнике NCBI.1 Но для простоты предположим, что после того, как распылитель произвел взрыв, в оставленных им фрагментах были следующие три:

 

Фрагмент 1: -----TCATGCTTGAC-----TACAGC

 

Фрагмент 2: TGCATCATGC-----GCTATACAGC

 

Фрагмент 3: -----TTGACGCGGCTATAC---.

 

Компьютер быстро определяет перекрывающиеся части этих фрагментов и способен собрать всю последовательность, которую они покрывают:

TGCATCATGCTTGACGCGGCTATACAGC

 

Этот процесс может работать, когда несколько копий генома данного организма собраны и раздроблены, чтобы получить различные фрагменты. Чем больше копий, тем больше шансов, что будут найдены участки с идентичными последовательностями ДНК и что случайные фрагменты могут быть скомпилированы компьютерами в контиги.

Еще проще представить себе, что кто-то распечатал несколько копий, скажем, статьи из New York Times и нарезал их по-разному, получив множество изо-лированных строк символов. Эти фрагменты не имеют смысла, пока вы не начнете находить в разных вырезках последовательности, которые точно совпадают. Возьмем, к примеру, первое предложение статьи о проекте "Геном человека", написанной в 2001 году Николасом Уэйдом.2 Вот несколько возможных фрагментов из нее:

 

/ е давно устоявшиеся представления о биологии человека. / Публикация первой интерпретации

/ На этой неделе было вынесено решение, опровергающее некоторые давние убеждения относительно интерпретации последовательности генома человека.

 

И вот эти фрагменты сшиты вместе, чтобы показать исходное предложение:

 

Опубликованная на этой неделе первая интерпретация последовательности генома человека переворачивает некоторые давно устоявшиеся представления о биологии человека.

 

Дробное секвенирование ЦЕЛОГО ГЕНОМА было впервые разработано в середине 1990-х годов, когда Крейг и Гамильтон "Хэм" Смит - нобелевский лауреат, близкий друг Крейга и его соратник по TIGR, Celera и JCVI - изобрели процесс секвенирования Haemophilus influenzae.

 

Другие использовали термин "дробовое секвенирование" для описания того, что они делали, что сбивает с толку", - говорит Крейг. "Например, Фред Сэнгер в 1977 году использовал этот термин для обозначения методов, с помощью которых он впервые секвенировал вирус Phi-X174".3 Так же поступила группа ученых из Калифорнийского университета в Дэвисе в 1981 году, которые использовали тот же подход, что и Сэнгер, когда секвенировали вирус цветной капусты Mo-saic. Но оба вируса были подготовлены к секвенированию не с помощью распылителей, разбивающих ДНК на маленькие случайные фрагменты, а с помощью более традиционного метода, использующего ферменты рестрикции. Они работают как химические ножницы, разрезая ДНК на части в точных местах генетической последовательности. Затем эти фрагменты секвенируются по одному и вручную соединяются в компьютере. Фактически именно Хэм Смит вместе с двумя другими учеными стал пионером в использовании ферментов рестрикции - это открытие принесло им Нобелевскую премию по медицине 1978 года.

"Вместо ферментов рестрикции, - говорит Крейг, - мы случайным образом разрезали ДНК на мелкие фрагменты - двадцать пять тысяч фрагментов в одной пробирке для первого генома. Затем все эти фрагменты были секвенированы, и двадцать пять тысяч фрагментов были точно собраны заново". Крейг писал об этом процессе секвенирования Haemophilus в книге "Жизнь со скоростью света": "В результате 1,8 миллиона пар оснований генома [Haemophilus] были воссозданы в компьютере в правильном порядке. Следующим шагом стала интерпретация генома и определение всех входящих в него генов".

В 1995 году команда изложила результаты се-квенирования Haemophilus и их интерпретацию в статье в журнале Science под названием "Полногеномное случайное секвенирование и сборка Haemophilus influenzae Rd": "Тот факт, что мы смогли собрать Haemophilus с помощью алгоритма так быстро и так точно, бросил вызов всем. "Они использовали тот же аргумент, что и при секвенировании генома человека, - что на секвенирование такого количества ДНК старыми методами уйдут десятилетия. Но потом мы добились успеха с Haemoph-ilus, доказав, что математически это можно сделать гораздо быстрее. Это также доказало, что с помощью этого метода можно секвенировать геном человека. Это было бы невозможно, если бы мы не сделали сначала Haemophilus".

Когда геном Haemophilus был опубликован, он добавил: "Фред Сэнгер даже прислал мне милую записку от руки... в которой сказал, что всегда верил, что мой подход сработает, но у него не было возможности проверить его, потому что его коллеги хотели получить свой собственный кусок ДНК".

После секвенирования Haemophilus influenzae и Mycoplasma genitalium Крейг привлек к себе большое внимание в СМИ и научных кругах. Хэма и Крейга пригласили прочитать президентскую лекцию в Американском обществе микробиологии на его ежегодном собрании в Вашингтоне. "Хэм представил меня, и я прочитал лекцию", - рассказывает Крейг. "В конце произошло редкое для науки событие: двадцать тысяч ученых поднялись на ноги и аплодировали нам стоя за секвенирование первого в истории организма".

"Этот успех позволил нам получить крупное финансирование и продолжить эти ранние эксперименты и проверки секвенирования дробовика с использованием бактерий", - говорит он. Одним из главных спонсоров, сторонников и болельщиков почти всех проектов Крейга после Haemophilus был Ари Патринос, который в 1995 году был назначен ответственным за биологические и экологические исследования в Управлении науки Министерства энергетики США (DOE). Позже Патринос вспоминал, как он упустил шанс профинансировать Haemophilus, потому что о том, что рецензенты из министерства энергетики наплевали на предложенный проект. "Я хотел профинансировать секвенирование первого микробного генома, - говорит он, - но все отзывы о проекте были отрицательными. Все эти эксперты считали, что Крейг не справится. В конце концов я отменил их решение, что мне было разрешено, но мне пришлось пройти через всю бумажную волокиту, чтобы добиться отмены решения, а тем временем Крейг раздобыл немного частных денег и смог профинансировать первую работу без DOE, потому что мне